简述质粒载体的结构与复制特征及其在分子生物学研究中的应用。

参考答案: 质粒载体是以细菌质粒的各种元件为基础组建而成的基因工程载体。细菌质粒是双链闭合环状DNA分子，其分子大小可从1kb到200kb。质粒的复制和遗传独立于细菌染色体，但其复制和转录依赖于宿主所编码的蛋白和酶。质粒按其复制方式分为松弛型质粒和严紧型质粒。前者的复制不需要质粒编码的功能蛋白，其复制完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶(如DNA聚合酶Ⅰ、Ⅲ，依赖于DNA的RNA聚合酶以及宿主基因dnaB、C、D、Z的产物等)来进行。因此，在一定的情况下即使蛋白质合成并非正在进行，质粒的复制依然进行。当在抑制蛋白合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素等抗生素存在时，其拷贝数可达2000～3000。后者的复制则要求同时表达一个由质粒编码的蛋白质，所以这类质粒的拷贝数不能通过诸如氯霉素等蛋白合成的抑制剂来增加。利用松弛型复制子组建的载体叫做松弛型载体(如pBR322，其复制区来源于ColE1质粒的复制子)；而利用严紧型复制子组建的载体叫做严紧型载体(如由pSC101为基础组建的载体)。大多数基因工程工作使用松弛型载体，因为它们在单位体积的培养物中所得到的DNA收率更高，用这些载体组建的表达载体，外源基因产物的得率也高，然而严紧型载体可以用来表达一些其高表达可能使宿主细胞受毒害致死的基因。松弛型质粒(如pMBI或ColE1)的单向复制从特异的起点开始，由一个RNA引物所引导，而该引物的启动子位于复制起始点上游大约550bp处。DNA模板链与新生的RNA间形成稳定的杂交体作为RNaseH的底物，由RNaseH切割前引物从而产生引导DNA合成的引物RNA Ⅱ。RNA Ⅱ的成熟则由另一个不翻译的RNA Ⅰ来控制，RNA Ⅰ由编码RNA Ⅱ的同一区段的DNA互补链转录而来，它可以与RNA Ⅱ结合，并阻止RNA Ⅱ折叠为三叶草结构，而这三叶草结构又是同DNA形成DNA-RNA杂交体所必需。一个由63个氨基酸组成的Rop蛋白的存在可以强化RNA Ⅰ对复制的负调控作用。 因此，要想增加带有pMBI或ColE1的复制子载体的拷贝数，可以通过突变RNA Ⅰ或缺失Rop基因来减弱RNA Ⅰ对RNA Ⅱ的结合效率来实现。PUC质粒(复制子为pMBI)的拷贝数之所以高就是因为使RNA Ⅰ转录起始点产生G→A的突变所致。pKKH质粒拷贝数增加，外源基因表达效率的提高是由于rop基因缺失所致。值得指出的是，质粒上编码的RNA Ⅰ、RNA Ⅱ和Rop蛋白的区段也决定两个不同的质粒是否可以在同一细菌细胞中共存。把利用同一复制系统的不同质粒不能稳定的共存的现象，称为质粒的不相容性。在基因工程的操作中要注意这一情况。