试述凝胶层析的原理与操作要点。

参考答案: 凝胶层析是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。
（1）、凝胶层析的基本原理：凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，各组分在层析柱内同时进行两种不同的运动，一种是随着溶液流动而进行垂直向下的移动，另一种是无定向的分子扩散运动（布朗运动）。大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。在凝胶层析中，相对分子质量也并不是唯一的分离依据，有些物质的相对分子质量相同，但由于分子的形状不同，再加上各种物质与凝胶之间存在着非特异性的吸附作用，故仍然可以分离。
（2）、凝胶层析操作要点：凝胶层析的操作一般包括装柱、上柱、洗脱等过程。装柱时首先选择好粗细均匀，一定直径和一定高度的层析柱，在柱的底部放置一层玻璃纤维或者棉花，柱内先充满洗脱剂（一般是水货缓冲液做洗脱剂），然后一边搅拌一边缓慢而连续地加入浓稠的凝胶悬浮液，让其自然沉降，直至达到所需的高度，要注意凝胶分布均匀，不能有气泡或裂纹存在。柱装好以后，不管使用与否，都应有洗脱液浸过凝胶表面，以免黁如空气而影响分离效果。
上柱是将欲分离的混合溶液加入凝胶层析柱的过程。要在洗脱液的液面恰好与凝胶床的表面相平时加入混合液，使组分能够均匀地进入凝胶床。上柱的混合液体积不能过大，通常为凝胶床体积的10%左右，最大不能超过30%。混合液的浓度可以高些，但是黏度宜低。
上柱完毕后，加进洗脱液进行洗脱。洗脱液应于干燥凝胶溶胀时及装柱平衡时所使用的液体完全一致，否则会影响分离效果。所使用的洗脱液体积一般为凝胶床体积的120%左右，洗脱流出液分部收集。洗脱完毕后，凝胶柱已经恢复酶液上柱前的状态，不用经过再生处理，就可以重复用于下一批酶液的分离纯化。